一．實驗目的
酶聯免疫吸附測定（enzyme-linked immunosorbent assay 簡稱ELISA）是在免疫酶技術（immunoenzymatic techniques）的基礎上發展起來的一種新型的免疫測定技術,ELISA過程包括抗原（抗體）吸附在固相載體上稱為包被，加待測抗體（抗原）, 再加相應酶標記抗體（抗原）,生成抗原（抗體）－－待測抗體（抗原）－－酶標記抗體的複合物，再與該酶的底物反應生成有色產物。藉助分光光度計的光吸收計算抗體（抗原）的量。待測抗體（抗原）的定量與有色產生成正比。
二．實驗原理
用於免疫酶技術的酶有很多，如過氧化物酶，鹼性磷酸酯酶，β－Ｄ－半乳糖苷酶，葡萄糖氧化酶，碳酸酐酶，乙酰膽鹼酯酶，6－磷酸葡萄糖脱氧酶等。常用於ELISA法的酶有辣根過氧化物酶，鹼性磷酸酯酶等，其中尤以辣根過氧化物酶為多。由於酶摧化的是氧化還原反應，在呈色後須立刻測定，否則空氣中的氧化作用使顏色加深，無法準確地定量。
辣根過氧化物酶（HRP）是一種糖蛋白，每個分子含有一個氯化血紅素（protonhemin）區作輔基。酶的濃度和純度常以輔基的含量表示。氯化血紅素輔基的最大吸收峯是403nm，HRP酶蛋白的最大吸收峯是275nm，所以酶的濃度和純度計算式是（已知HRP的A（1cm 403nm 1%）＝25，式中1％指HRP百分濃度為100ml含酶蛋白1g，即10mg/ml，所以，酶濃度以 mg/ml 計算是HRP的A（1cm 403nm mg/ml=2.5）HRP純度（RZ）=A403nm/A275nm純度RZ（Ｒeinheit Zahl）值越大説明酶內所含雜質越少。高純度HRP的RZ值在3.0左右，最高可達3.4。用於ELISA檢測的HRP的RZ值要求在3.0以上。
ELISA的基本原理有三條：
（1）抗原或抗體能以物理性地吸附於固相載體表面，可能是蛋白和聚苯乙烯表面間的疏水性部分相互吸附，並保持其免疫學活性；
（2）抗原或抗體可通過共價鍵與酶連接形成酶結合物，而此種酶結合物仍能保持其免疫學和酶學活性；
（3）酶結合物與相應抗原或抗體結合後，可根據加入底物的顏色反應來判定是否有免疫反應的存在，而且顏色反應的深淺是與標本中相應抗原或抗體的量成正比例的，因此，可以按底物顯色的程度顯示試驗結果。
ELISA法是免疫診斷中的一項新技術，現已成功地應用於多種病原微生物所引起的傳染病、寄生蟲病及非傳染病等方面的免疫診斷。也已應用於大分子抗原和小分子抗原的定量測定，根據已經使用的結果，認為ELISA法具有靈敏、特異、簡單、快速、穩定及易於自動化操作等特點。不僅適用於臨牀標本的檢查，而且由於一天之內可以檢查幾百甚至上千份標本,因此，也適合於血清流行病學調查。本法不僅可以用來測定抗體，而且也可用於測定體液中的循環抗原，所以也是一種早期診斷的良好方法。因此ELISA法在生物醫學各領域的應用範圍日益擴大，可概括四個方面：
1、免疫酶染色各種細胞內成份的定位。
2、研究抗酶抗體的合成。
3、顯現微量的免疫沉澱反應。
4、定量檢測體液中抗原或抗體成份。
基本方法一 用於檢測未知抗原的雙抗體夾心法:
1. 包被：用0.05M PH9.牰碳酸鹽包被緩衝液將抗體稀釋至蛋白質含量為1～10μg／ml。在每個聚苯乙烯板的反應孔中加0.1ml，4℃過夜。次日，棄去孔內溶液，用洗滌緩衝液洗3次，每次3分鐘。（簡稱洗滌，下同）。
2. 加樣：加一定稀釋的待檢樣品0.1ml於上述已包被之反應孔中，置37℃孵育1小時。然後洗滌。（同時做空白孔，陰性對照孔及陽性對照孔）。
3. 加酶標抗體：於各反應孔中，加入新鮮稀釋的酶標抗體（經滴定後的稀釋度）0.1ml。37℃孵育0.5～1小時，洗滌。
4. 加底物液顯色：於各反應孔中加入臨時配製的TMB底物溶液0.1ml，37℃10～30分鐘。
5. 終止反應：於各反應孔中加入2M硫酸0.05ml。
6. 結果判定：可於白色背景上，直接用肉眼觀察結果：反應孔內顏色越深，陽性程度越強，陰性反應為無色或極淺，依據所呈顏色的深淺，以“+”、“-”號表示。也可測O·D值：在ELISA檢測儀上，於450nm（若以ABTS顯色，則410nm）處，以空白對照孔調零後測各孔O·D值，若大於規定的陰性對照OD值的2.1倍，即為陽性。
基本方法二 用於檢測未知抗體的間接法：
用包被緩衝液將已知抗原稀釋至1～10μg／ml， 每孔加0.1ml，4℃過夜。次日洗滌3次。 ↓
加一定稀釋的待檢樣品（未知抗體）0.1ml於上述已包被之反應孔中,置37℃孵育1小時,洗滌。（同時做空白、陰性及陽性孔對照） ↓
於反應孔中，加入新鮮稀釋的酶標第二抗體（抗抗體）0.1ml，37℃孵育30-60分鐘，洗滌,最後一遍用DDW洗滌。 ↓
其餘步驟同“雙抗體夾心法”的4、5、6。
（二） 酶與底物
酶結合物是酶與抗體或抗原, 半抗原在交聯劑作用下聯結的產物。是ELISA成敗的關鍵試劑，它不僅具有抗體抗原特異的免疫反應，還具有酶促反應，顯示出生物放大作用，但不同的酶選用不同的底物。
免疫技術常用的酶及其底物
* 終止劑為2mol/L H2SO4
** 終止劑為2 mol/L檸檬酸， 不同的底物有不同的終止劑。
可催化下列反應： HRP+H2O2→複合物 複合物+AH2→過氧化物酶+H2O+A AH2 ——為無色底物, 供氫體； A—— 為有色產物。
（三） ELISA常用的四種方法
1．直接法測定抗原 將抗原吸附在載體表面；
加酶標抗體，形成抗原—抗體複合物； 加底物。底物的降解量＝抗原量。
2．間接法測定抗體
將抗原吸附於固相載體表面； 加抗體, 形成抗原-抗體複合物； 加酶標抗體；
加底物。 測定底物的降解量＝抗體量。
3．雙抗體夾心法測定抗原
將抗原免疫第一種動物獲得的抗體吸附於固相表面;加抗原，形成抗原-抗體複合物;
加抗原免疫第二種動物獲得的抗體，形成抗體抗原抗體複合物;加酶標抗抗體（第二種動物抗體的抗體）; 加底物。底物的降解量＝抗原量。
4. 競爭法測定抗原
將抗體吸附在固相載體表面;
（1） 加入酶標抗原；
（2）,（3）加入酶標抗原和待測抗原；
加底物。對照孔與樣品孔底物降解量的差＝未知抗原量。